戚向阳(1)陈维军(2)彭光华(1)谢小浩(1)

(1.华中农业大学食品科技系  武汉·430070)；2.中化宁波进出口公司  宁波·315000),

摘要：利用D-脱氧核糖法，测定不同类胡萝卜素、VE和多酚提取物对·OH的清除作用，结果表明：与VE相比，类胡萝卜素及多酚提取物均具有较强的清除·OH的效果，其中以虾青素（又名超级维生素E）的清除能力最强，EC50值为0.02mg／mL。

关键词：羟基自由基(·OH )；清除效果；类胡萝卜素

中图分类号：TS202.3     文献标识码：A      文章编号：1005-9989(2003)03-0039-03

 前 言  

活性氧自由基主要有超氧阴离子、羟基自由基(·OH ),和单线态氧(·O2 ),三种形式，在自然界普遍存在。通常情况下，体内自由基的产生和清除处于动态平衡中，参与杀菌、物质代谢等重要生理功能。但当自由基产生过多或体内清除能力下降时，会引起蛋白质损伤、酶失活、膜脂过氧化，导致衰老、肿瘤、动脉粥样硬化等许多疾病的发生。

类胡萝卜素为一类具有聚异戊二烯长链结构的不饱和化合物，大量的研究表明类胡萝卜素具有抗氧化、预防肿瘤、抗突变、增强特异性及非特异性免疫功能和预防老年性痴呆及抗光敏等多种生物活性。许多研究表明：类胡萝卜素在生物系统的保护作用主要归功于它们的抗氧化作用，但目前对于其抗氧化活性的研究主要集中在类胡萝卜素对超氧阴离子的清除效果，而关于其清除羟基自由基的研究却很少。众所周知，羟基自由基是危害最大的一种活性氧自由基，可导致癌症、衰老等疾病的发生。因此，本文通过D-脱氧核糖法研究类胡萝卜素清除羟基自由基的效果，为类胡萝卜素在食品、医药、化妆品等方面的应用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、VE：Sigma Co；

虾青素超级维生素E)(浓度为42.1%)、虾青素(浓度为71.6%): 实验室制备。

1.2 主要试剂

D-脱氧核糖：Sigma Co；

TBA： 中国医药集团上海化学试剂公司；

四氢呋喃、正丁醇、EDTA、KOH、KH2PO4、FeCl3、VC、H₂O₂、HCL：均为分析纯。

1．3 主要仪器

  572紫外可见分光光度计：上海分析仪器总厂。

1．4 实验方法

1．4．1 类胡萝卜素清除·OH效果    D-脱氧核糖法。在10ML具塞刻度试管中依次加入PH7.4的K₂H₂PO₄缓冲溶液0.4ML，一定量的样品液(≤100μL），1.04MMOL/L EDTA0.1ML,1MMOL/L FECL₃ 0.1ML,12MMOL/L H₂O 0.1ML,60MMOL/L 脱氧核糖(DR)0.1ML,2MMOL/L抗坏血酸0.1ML,加水使总体积为1ML。然后将试管置 37℃的恒温水浴锅中保持1h，取出后迅速添加1mL25%HCL及1%TBA1mL，在 100℃沸水中加热15min取出，迅速冷却，若有混浊，可加入3mL正丁醇萃取，以不加样品及DR的试剂为空白，然后于532nm处测定吸光值。按下式计算清除率：

  式中：A₀———不加样品液时的吸光值；

        A₁₁———加入样品后的吸光值；

        A₁₀———不加DR的样品吸光值。

1.4.2 类胡萝卜素样品液的制备    取一定量的样品用四氢呋喃溶解并定容至一定浓度，然后取不同体积的样品测定其对·OH的清除作用。

2 结果与分析

2.1 低浓度类胡萝卜素对羟基自由基的清除效果

  低浓度类胡萝卜素及V_E对羟基自由基的清除效果见表1和图1。

  由表1和图1可知，样品浓度对类胡萝卜素及V_E清除羟基自由基的能力影响很大。β-胡萝卜素、叶黄素和V_E在浓度较低时，不仅没有清除羟基自由基的能力，还可激发自由基的产生。在所试的浓度范围内，随浓度的升高，类胡萝卜素及V_E清除羟基自由基的效果增强。由表1和图1还可看出，当浓度相同时，类胡萝卜素清除羟基自由基的效果均远远高于V_E，其中以浓度为71.6%的虾青素样品的清除能力最好，其EC₅₀值仅为0.02 mg/mL

2.2 高浓度类胡萝卜素清除羟基自由基的效果

  高浓度类胡萝卜素及V_E对羟基自由基的清除效果见表2和图2。

由表2及图2可知，在高浓度条件下，随浓度升高，几种类胡萝卜素清除羟基自由基的效果大大提高，β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素清除羟基自由基的EC₅₀值分别为300μg/mL、410μg/mL、680μg/mL。但V_E在此浓度范围内其清除羟基自由基的能力随浓度的增大变化极少，不呈一定的线形关系，当浓度达到1000μg/mL时，其对羟基自由基的清除率仅为16.7%，远远低于其它类胡萝卜素的清除率。

综上所述，几种类胡萝卜素对·OH均有较好的清除效果，并且各种类胡萝卜素清除羟基自由基(·OH)的能力是随着它们的浓度升高而增强；同时，在相同浓度条件下，类胡萝卜素对·OH的清除效果均远远高于V_E。葡萄籽提取物和茶多酚含有多种酚类物质，具有很强的抗氧化作用，已广泛应用于食品、药品和化妆品。因此，为了更一步了解不同类胡萝卜素抗氧化能力，在浓度相同的条件下，比较了类胡萝卜素及茶多酚等几种常用天然抗氧化剂对·OH的清除效果，结果见表3。

  从表3可看出，在浓度均为0.10mg/mL条件下，β—胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、虾青素及V_E均有一定清除羟基自由基(·OH)的效果，其中以虾青素的效果最佳，达到100%，其清除·OH的能力远远高于茶多酚及葡萄籽提取物，表明虾青素（超级维生素E）是一种活性很强的抗氧化剂。

3 讨论

本文的实验结果表明，不同类胡萝卜素对羟基自由基的清除作用存在很大差异，以虾青素（又名超级维生素E）的清除效果最强，β-胡萝卜素及叶黄素的清除能力相当，而番茄红素较差。这主要是由于类胡萝卜素清除自由基的能力不仅同结构中的共轭双键数目有关，还同其取代基团密切相关。通常类胡萝卜素淬灭活性氧、清除自由基的能力随着共轭双键数目的增加而增加，但紫罗酮环上4与4’位和3与3’位的取代基对类胡萝卜素淬灭氧的能力影响也很大。叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素的共轭双键数目分别是10、11、13，β-胡萝卜素作为抗氧化剂是由于它能与过氧化物自由基形成加合物或传递一个电子到过氧化物自由基而生成相应的阳离子基团。当胡萝卜素结构中引入羟基后，如叶黄素，其抗氧化活性与只含碳氢元素的胡萝卜素相比并没有明显的改变。但α-羟基酮基类胡萝卜素——虾青素却显示了很高的抗氧化活性，这可能是由于酮基使羟基激活，从而促进了氢转移到过氧化物自由基上；此外，4与4’位置上存在的酮基对于增加虾青素的抗氧化性能也很重要，这些酮基会引起沿着多烯链上的电子密度发生实质性的变化，特别是自由基最可能进攻的靠近环的一端；而3与3’位置上存在的羟基不能改变共轭二烯链的长度，从而不影响虾青素（超级维生素E）与自由基的反应性。番茄红素的共轭双键数虽然比叶黄素多，而本文采用反应体系为水相体系，属无环类类胡萝卜素的番茄红素的极性比较弱，而叶黄素结构中的羟基可能会增强反应体系中分子之间的进一步作用，从而增强了其对自由基的清除能力。

4 结论

  β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、虾青素（又名超级维生素E)均对羟基自由基有一定的清除作用，其中效果最强的是虾青素，其清除羟基自由基的能力远远大于天然抗氧化剂V_E、茶多酚和葡萄籽提取物。该实验的结果显示，在清除自由基的各种抗氧化物质中，虾青素（超级维生素E）具有极大的发展潜力。